RESISTÊNCIAS AOS ANTIRETROVIRAIS

(O programa desta conferência encontra-se em http://www.aidscongress.net/1congresso/ )

I Congresso Virtual HIV/AIDS : Portugal 2000: À Descoberta de Desafios Partilhados na Luta Contra a SIDA

RESISTÊNCIAS AOS ANTIRETROVIRAIS

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Conferência:

I Congresso Virtual HIV/AIDS : Portugal 2000: À Descoberta de Desafios Partilhados na Luta Contra a SIDA

Tópico:

Investigação

Autor(es):

Ricardo Camacho

Co-autor(es):

Palavras-chave:

Leituras:

10287

Resumo:

Comunicação:

RESISTÊNCIAS AOS ANTIRETROVIRAIS

Ricardo Camacho

O uso generalizado de fármacos anti-retrovirais alterou significativamente, durante a última década. o tratamento dos doentes infectados pelo HIV (1,2). Particularmente após 1996, a utilização de multiterapias ou HAART (acrónimo anglo-saxónico para Highly Active Antiretroviral Therapy), que incluem geralmente 2 fármacos inibidores da transcriptase reversa (RTI) e um inibidor da protease (PI) virais, ou, em alternativa a este último, um inibidor não-nucleosido da transcriptase reversa (NNRTI), ou ainda 3 RTIs, teve como resultado uma dramática melhoria do prognóstico da infecção HIV, bem expressa aliás na queda de mortalidade verificada nos Estados Unidos entre 1996 e 1997: 42% (24) bem como numa redução acentuada no número e severidade das infecções oportunistas. O optimismo foi tal que, embora ninguém o assumisse claramente, a palavra "erradicação" foi claramente um dos termos mais citados no XI International Conference on AIDS, ocorrida em Julho de 1996, em Vancouver, particularmente após a apresentação de David D. Ho, (The decay Characteristics of HIV Compartments), onde, com os dados de um grupo de doentes tratados precocemente na infecção com uma terapêutica agressiva e recorrendo a um modelo matemático, calculou em aproximadamente três anos o tempo necessário para a erradicação do HIV de um indivíduo infectado.
Não durou muito o optimismo. A toxicidade dos fármacos disponíveis (25), a constatação de que o HIV poderia sobreviver nalguns reservatórios (ou "santuários") dificilmente penetráveis pelos fármacos anti-retrovirais (SNC, órgãos genitais) (7) obrigou à revisão dos conceitos originais de David Ho; recentemente, o tempo para erradicação foi recalculado em 60 anos, o que na prática confirma a erradicação como uma impossibilidade prática com as terapêuticas actualmente disponíveis.
Os objectivos da terapêutica anti-retroviral passaram a ser a supressão máxima da replicação viral, a restauração e/ou preservação da função imune, melhoria da qualidade de vida do doente, e redução da morbilidade e mortalidade relacionada com a infecção HIV. (3). Estes objectivos são atingidos quando a carga viral (n.º de moléculas de RNA viral) no plasma se torna indetectável (<50 cópias/ml, com os métodos standard actualmente disponíveis), um nível no qual a resistência aos anti-retrovirais tem menos probabilidades de ocorrer.(1,4) A impossibilidade suprimir completamente a replicação viral conduz quase invariavelmente à selecção de variantes resistentes às drogas. Esta impossibilidade pode decorrer de vários mecanismos: má aderência do doente à terapêutica (com terapêutica irregular ou auto-suspensões), toxicidade dos fármacos que obrigam à sua suspensão, limitada potência do regime terapêutico escolhido, má absorção entérica (9), interacções medicamentosas conduzindo à redução dos níveis plasmáticos das drogas,  clearance demasiado rápida ou metabolização alterada, déficit da fosforilação intracelular (necessária para transformar alguns fármacos - AZT, d4T - na sua forma activa), (10) ou mecanismos da membrana celular que retiram os fármacos da célula, impedindo o seu acesso ao vírus, como o mecanismo da P-glicoproteína ou das MRPs (Multidrug Resistant Proteins) (14, 27), particularmente importantes no caso de alguns inibidores da protease.

 

Fig 1: Mecanismos de membrana celular que retiram os fármacos da célula: as bombas de fluxo/refluxo da P-glicoproteína e as MRPs (Multidrug Resistant Proteins)


Isoladamente ou, mais frequentemente, em conjunto, estes factores contribuem para que os insucessos terapêuticos - expressos como o reaparecimento de uma carga viral detectável no plasma após um período de supressão, ou a subida da carga viral 0,5 log10 acima do seu valor mais baixo, caso a supressão nunca tenha sido completa, em pelo menos duas determinações sequenciais) (28) - acabem por afectar uma percentagem muito significativa dos doentes sob terapêutica, variando entre 50% (29) e 38% (22), consoante os estudos e o período de avaliação. Independentemente do factor que está na base do insucesso terapêutico, a resistência a um ou mais fármacos do regime medicamentoso instituído acaba por ocorrer, constituindo-se como a principal - mas não a única - causa desse mesmo insucesso. (10)
 

 

Fig 2: A) Terapêutica eficaz, com supressão máxima

 B) terapêutica ineficaz, com selecção de mutações

A resistência do HIV aos fármacos anti-retrovirais é o produto da  alta taxa de replicação e mutação deste vírus, combinada com a sua capacidade de integração genómica e latência. A semi-vida dos virions do plasma pode ser tão curta como 6 horas, com 10 biliões de virions sendo produzidos cada dia num doente não tratado (30) . A transcriptase reversa do HIV, codificada pelo gene pol (polimerase), não tem capacidade "proofreading" (entendida como capacidade de analisar as novas sequências resultantes da replicação viral e eliminar as que não estão conformes a sequência original), permitindo desta forma que ocorram regularmente mutações espontâneas.(1) Uma média de 1 mutação ocorre em cada ciclo de replicação, permitindo virtualmente que qualquer das mutações associadas a resistência medicamentosa possa ocorrer no mínimo uma vez por dia. Muitas destas mutações resultam em vírus defectivos, incapazes de replicar e portanto inviáveis; outras, no entanto, retêm alguma capacidade de replicação ("fitness") que lhes permite manterem-se em circulação. Esta grande taxa de mutação permite a acumulação de um complexo de variantes, geneticamente relacionadas entre si mas distinguíveis através de  uma ou mais mutações pontuais chamado quasispecies.(5) Na presença de alterações ambientais criadas pela terapêutica, só a variante com maior capacidade de replicação nessas condições será capaz de emergir e tornar-se dominante. A mudança dos fármacos resulta numa mudança da estirpe dominante; mesmo uma população viral extremamente minoritária sob condições normais pode tornar-se dominante sob a pressão selectiva de uma terapêutica anti-retroviral.(4)



Tipos de testes utilizados na detecção de resistência aos antiretrovirais

Para a detecção de resistência aos anti-retrovirais, dois tipos de testes têm sido desenvolvidos: testes genotípicos e testes fenotípicos. Os primeiros identificam a presença de mutações relacionadas com resistência a fármacos específicos. São, portanto, uma forma indirecta de avaliação da acção potencial de um fármaco. As mutações conhecidas como conferindo uma susceptibilidade reduzida aos antiretrovirais estão descritas em diversos artigos de revisão (6,7,8) e são permanentemente actualizadas na Web, no site oficial do Laboratório Nacional de Los Alamos, Estados Unidos (HIV sequence database, http://lanl.gov.) ou da Universidade de Stanford ( http://hivdb.stanford.edu/hiv/ )
Os testes genotípicos, qualquer que seja o seu formato, empregam geralmente um procedimento em duas fases: em primeiro lugar, a amplificação por RT-PCR de uma região específica do genoma viral, após o que se procede à detecção da ou das mutações.
 Três tipos de testes genotípicos estão ou estarão a curto prazo no mercado: os "point mutation assays", (17,18) onde são colocadas sondas específicas para as diversas mutações conhecidas numa tira de nitrato de celulose, procedendo-se à sua detecção por uma reacção de hibridização com o produto da amplificação por RT-PCR do gene pol do HIV. Apesar da sua maior simplicidade e menor preço, apresentam inconvenientes importantes, como a impossibilidade de actualizar rapidamente o quadro de mutações disponível à medida que novos fármacos ou novas interacções de fármacos introduzem alterações genómicas até então desconhecidas no HIV.
Actualmente, a sequenciação genómica (uma modificação da técnica original descrita por Sanger et al) (12, 13, 18) dos fragmentos significativos do gene pol (protease e transcriptase reversa), é considerada o "golden standard" deste tipo de metodologia. A disponibilidade da quase totalidade dos fragmentos genómicos do HIV significativos na avaliação da resistência aos antiretrovirais permite a sua actualização constante. Tem no entanto o inconveniente de ser mais caro, mais moroso, e exigir um laboratório altamente especializado para a sua execução e, principalmente, interpretação.
Dentro de pouco tempo, a tecnologia de microchip arrays (16, 18) irá fazer a sua entrada no mercado. Reputada como de maior facilidade de execução, fiabilidade da resposta, e menor preço, pode vir a ter um papel importante. No entanto, apenas está disponível, de momento, a nível experimental.
Os testes fenotípicos medem a concentração de uma droga necessária para inibir em 50% (IC50) ou em 90% (IC90) a replicação viral em culturas in vitro, constituindo assim uma medida directa da resistência a uma ou mais drogas específicas. Este facto confere-lhe vantagens significativas sobre os testes genotípicos: quantificação, maior facilidade de interpretação dos resultados e avaliação da resistência cruzada entre fármacos da mesma classe; no entanto, a sua morosidade (2 a 3 semanas, contra 3 a 4 dias de um teste genotípico), preço (aproximadamente 200.000$00) (31)  e extraordinária complexidade técnica só permitem que seja executado em laboratórios altamente qualificados, credenciados quase exclusivamente para este fim, e quase todos trabalhando, maioritariamente, na área da investigação. Tudo isto limita, obviamente, o seu uso clínico generalizado, que não se prevê venha a ocorrer a curto prazo.
Uma alternativa importante e promissora foi recentemente proposta pela empresa VIRCO. Designada "fenotipo virtual", consiste na comparação das sequências obtidas num teste genotípico com a informação contida numa grande base de dados, que inclui determinações de genotipos e fenotipos obtidos em paralelo de alguns milhares de amostras.  Assim, o modelo informático selecciona as sequências mais próximas da amostra em estudo e o fenotipo correspondente. Este método permite uma aproximação superior a 90% ao resultado de um teste fenotípico, a uma fracção do custo.

Validação da utilização na clínica dos testes de resistência aos antiretrovirais

A evidência a favor da utilidade clínica dos testes de resistência veio de estudos retrospectivos e prospectivos. O estudo GART (Genotypic Antiretriviral Resistance Testing) (21) constituiu um estudo randomizado, incluindo 153 doentes com um insucesso terapêutico prévio num regime que incluía um inibidor da protease. Os doentes foram divididos em dois braços: o primeiro recebeu os resultados de testes genotípicos e aconselhamento especializado, enquanto o segundo usou apenas o tratamento standard. O primeiro grupo teve uma redução da carga viral mais marcada às 4 e 8 semanas (1.19 vs 0.62 log10 cópias/ml). A percentagem de doentes com carga viral indetectável foi também superior no grupo tratado com recurso a orientação de um teste genotípico: 34% contra 22%.
O estudo francês VIRADAPT (15) seguiu moldes muito semelhantes. Aos seis meses de terapêutica, os doentes do grupo acompanhado com o auxílio de testes genotípicos de resistência tinham uma redução da carga viral de 1,15 log10 , contra uma redução de apenas 0,62 log10 no grupo de controlo. A percentagem de doentes que atingiram uma carga viral indetectável no plasma também foi significativamente mais elevada no primeiro grupo (29% vs 14%)
 

Fig 3: Resultados do estudo VIRADAPT

Finalmente, o estudo VIRA 3001 comparou o impacto da utilização prospectiva de testes fenotípicos nas alterações terapêuticas, quando comparado com o tratamento standard (19). Um total de 274 doentes foram randomizados em dois grupos, um com utilização de testes fenotípicos (n=144) e outro com tratamento standard (n=130). A mediana da diminuição da carga viral no primeiro grupo foi de -1,27 log10, contra apenas -0,75 log10 no grupo controle. A percentagem de doentes que alcançou o objectivo de uma carga viral indetectável foi também superior no grupo que utilizou os testes fenotípicos: 38% contra 23%.
Mais recentemente, um estudo francês (NARVAL) não obteve os mesmos resultados, colocando em questão a utilidade destes testes. No entanto, o design do estudo tem sido fortemente criticado, já que os doentes incluídos eram todos doentes com múltiplas tratamentos anteriores, cujas opções terapêuticas eram praticamente nulas - uma situação em que estes testes, reconhecidamente, não têm grande utilidade.
Para além destes estudos prospectivos, um grupo de trabalho americano (Resistance Collaborative Group, Clinical Validation Subcommittee) analisou 11 estudos retrospectivos, onde foram utilizados testes genotípicos ou fenotípicos; todas as conclusões foram concordantes a favor do valor preditivo independente dos testes de resistência aos antiretrovirais em relação ao potencial insucesso de um fármaco.(32) O mesmo não se verificou em relação à capacidade dos testes de preverem a susceptibilidade a uma determinada droga, dadas as suas limitações em detectar populações virais minoritárias; assim, os testes identificam resistência, mas não identificam susceptibilidade. Como consequência, este grupo elaborou guidelines para utilização destes testes na prática clínica (3, 23) . Na Europa foi seguido um processo semelhante, com as guidelines a serem elaboradas pelo Euroguidelines Group (33).

Mecanismos de resistência às drogas

As mutações genéticas do HIV podem ser classificadas como primárias, secundárias, ou polimorfismos naturais. As primeiras alteram a ligação de uma droga ao seu alvo específico, e resultam num aumento constante da quantidade de droga necessária para inibir o enzima-alvo (protease, transcriptase reversa). As mutações secundárias são incapazes, na ausência de mutações primárias, de conferir resistência farmacológica, mas quando aquelas ocorrem, contribuem para reconstituir a capacidade replicativa do vírus, mais ou menos afectada pela alteração genómica primária. Finalmente os polimorfismos naturais, consistindo em variantes genéticas com capacidade de replicação semelhante à variante wild type (logo, sem expressão fenotípica) ocorrem com frequência em doentes não submetidos a qualquer terapêutica. (34).

Resistência aos inibidores nucleosidos da Transcriptase Reversa (NRTIs)

A resistência aos NRTIs pode desenvolver-se através de uma única mutação ou, em alternativa, uma acumulação sucessiva de mutações. Um exemplo deste último caso é a resistência que se desenvolve à Zidovudina (AZT). Após um insucesso terapêutico após monoterapia com AZT , torna-se detectável uma mutação no codon 70 da transcriptase reversa, seguida por mutações nos codons 41 e 215 e, finalmente, 67 e 219. Este padrão confere ainda uma resistência cruzada mais ou menos importante a outros fármacos da mesma classe, como a Estavudina (d4T) (11, 20, 28) e o Abacavir (ABC), apesar de estes fármacos desencadearem, eles próprios, o seu próprio perfil de mutações de resistência: no codon 75 no caso da Estavudina (um achado raro, por razões ainda não esclarecidas) e nos codons 65, 74 e 184 para o Abacavir. De um fármaco como a Zidovudina, para o qual o desenvolvimento de resistência  necessita  de uma série de mutações diz-se que tem uma alta barreira genética.

 

Fig 5: o conceito de barreira genética

Um exemplo de uma baixa barreira genética, pelo contrário, é-nos dado pelo alto grau (>1000 X) de resistência à Lamivudina (3TC) que emerge rapidamente como resultado da mudança de um único nucleótido no codon 184 - uma adenina por uma citosina, mudando o aminoácido resultante de uma metionina para uma valina. No entanto, o vírus com esta mutação fica seriamente afectado na sua capacidade replicativa.(35) A presença desta mutação pode restaurar parcialmente a sensibilidade à Zidovudina num doente previamente resistente àquele fármaco, (37)  num exemplo claro de interacção entre mutações, uma de várias observações que tornam extremamente difícil a interpretação de um teste genotípico.
A resistência a Didanosina (ddI) e a Zalcitabina (ddC), outros dois fármacos desta classe, desenvolve-se muito lentamente (após 6 a 12 meses de monoterapia) e está associada à substituição de uma leucina por uma valina no codon 74. Finalmente, dois conjuntos de mutações conferem resistência a todos os fármacos desta classe: a mutação no codon 151 (Q151M) e a inserção de duas serinas na região do codon 69. Estas mutações estão descritas após terapêuticas prolongadas e conferem um grau moderado ou alto de resistência a todas as drogas desta classe.

Resistência aos Inibidores Não-Nucleosidos da Transcriptase Reversa (NNRTIs)

As drogas disponíveis desta classe incluem a Nevirapina (NVP), a Delavirdina (DLV) e o Efavirenz (EFV). As mutações que conferem resistência a estes fármacos ocorrem em dois clusters, entre os codons 100-108 e 179-190. A resistência à monoterapia com qualquer destes fármacos ocorre muito rapidamente (num recente ensaio no Uganda sobre prevenção da transmissão vertical com utilização de Nevirapina, 25% das mulheres participantes adquiriram resistência após 1 único comprimido de 200 mg (36) ) bastando uma única mutação - geralmente K103N ou Y181C - para conferir um alto grau de resistência (>100x) a toda esta classe de fármacos. (Se bem que o vírus portador da mutação Y181C retenha alguma sensibilidade ao Efavirenz). Tudo isto implica que estes fármacos devem ser empregues em esquemas terapêuticos de alta potência, por forma a minimizar estes problemas.

Resistência aos inibidores da protease (PI)

As drogas disponíveis nesta classe incluem o Indinavir (IDV),  Ritonavir (RTV), Saquinavir (SQV), Nelfinavir (NFV) e Amprenavir (APV), e brevemente o Lopinavir + Ritonavir (Kaletra). Pelo menos 42 mutações ocorrendo em 27 codons têm sido associadas a resistência a estes fármacos, muitas das quais interferem com a ligação do inibidor. Tanto as mutações primárias como as secundárias contribuem, aqui, para o desenvolvimento de resistência. Apesar das mutações primárias serem relativamente específicas da cada fármaco, a acumulação de mutações secundárias partilhadas por várias drogas contribui para o aparecimento de resistência cruzada. (6) A complexidade na interpretação dos testes genotípicos em relação a esta região do genoma está ainda acrescida devido ao facto de esta ser uma região altamente polimórfica, podendo estar bastante alterada mesmo em indivíduos que não tenham feito qualquer terapêutica.
O desenvolvimento de alto grau de resistência ao Indinavir e Ritonavir requer uma acumulação de sucessivas mutações. A primeira mutação detectável, habitualmente, é a que ocorre no codon 82, onde uma valina é substituída por uma trionina, alanina ou fenilalanina. A resistência ao Saquinavir está associada às mutações G48V ou L90M, sendo esta última a primeira a ser detectável laboratorialmente. A estas, múltiplas mutações secundárias se podem adicionar, conferindo resistência cruzada a outros fármacos desta classe.
A resistência ao Nelfinavir resulta da selecção de uma única mutação primária no codon 30, específica para esta droga e que não confere resistência cruzada para os outros inibidores da protease. Contudo, a continuação do tratamento resulta na acumulação de mutações nos codons 71, 77, 88 e 90, conferindo resistência cruzada a outros fármacos desta classe, particularmente ao Saquinavir. Uma segunda via de resistência, iniciando-se no codon 90, está também descrita para este fármaco, desconhecendo-se quais as condicionantes para a selecção de uma ou outra.
Finalmente, a resistência ao Amprenavir resulta do aparecimento de uma mutação no codon 50 - substituição de uma isoleucina por uma valina - específica deste fármaco e que não confere resistência cruzada aos outros inibidores da protease. A continuação do tratamento, no entanto, provoca a selecção de outras mutações, particularmente nos codons 10 e 54; no entanto, a resistência cruzada com os outros fármacos, apesar de existir, é a menor nesta classe.
Finalmente, o que se sabe sobre as mutações seleccionadas pela combinação Lopinavir - Ritonavir, parece ser que estas coincidem, de alguma forma, com as mutações que conferem resistência ao Indinavir e Ritonavir. De qualquer forma, o seu sucesso contra estirpes virais resistentes vem demonstrar um conceito que, na programação de uma terapêutica , é necessário ter sempre presente: a resistência não é um valor absoluto; é quantificável e pode, nalguns casos, ser ultrapassada pela potência do regime (26).
 

Fig. 6: A resistência pode ser ultrapassada com o aumento da potência de um regime terapêutico

Persistência de mutações de resistência aos antiretrovirais na população infectada pelo HIV-1 com insucesso terapêutico

A generalização da terapêutica antiretroviral conduziu, como já atrás foi referido, a uma melhoria acentuada na capacidade de tratamento dos doentes infectados pelo HIV. Infelizmente, após um primeiro ano de melhorias espectaculares em relação ao número de óbitos e progressão para SIDA - 42% em 1996/1997, nos Estados Unidos - seguiu-se outro ano em que essa melhoria se reduziu para metade - 20% em 1997/1998 (24). No ano seguinte, nalguns locais como San Francisco e Miami, assistiu-se mesmo a um ligeiro aumento do número de óbitos, o que pode indicar que os fármacos actualmente disponíveis estão perto de esgotar a sua capacidade terapêutica nos doentes mais pesadamente tratados.
Um estudo publicado recentemente (39) envolvendo 11.990 amostras de doentes americanos sob terapêutica antiretroviral e com carga viral detectável no plasma, revelou que 79,2% eram portadores de vírus com mutações de resistência; 25% destes vírus tinham mutações que lhes conferiam resistência às três classes de drogas actualmente disponíveis.
Em Portugal, um estudo realizado em 261 doentes nas mesmas circunstâncias revelou que 89,7% eram portadores de vírus com mutações que lhes conferiam resistência a uma (21%) duas (42%) ou às três (27%) classes de drogas disponíveis.
 

 

Fig 7: prevalência de doentes em falência terapêutica  infectados com variantes resistentes em Portugal

O elevado número de doentes portadores de variantes virais resistentes a uma ou mais classes de fármacos justificou fundados receios de que se estivessem a verificar novas infecções com vírus resistentes.(38) Essa preocupação, pelas graves consequências para a saúde pública que encerra, levou à realização de múltiplos estudos (40,41,42,43,44,45,46) em diversos países, que quantificaram a transmissão de variantes resistentes entre 2 e 33%, consoante a localização geográfica, tipo de doente estudado e tempo decorrido após a infecção. Em Portugal, esse número é, actualmente, de 17%, num pequeno estudo efectuado em doentes infectados há menos de 6 meses. Razões mais do que suficientes para que este problema seja alvo de vigilância epidemiológica eficaz, por forma a que possam ser tomadas as medidas preventivas adequadas.


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